微乳液可分為單相微乳液和多相微乳液(Winsor型微乳液),一般由油､水(鹽水)､表面活性劑和助表面活性劑等4元組分組成｡前者是一個均勻相體系,它有3種結構之分,油包水型微乳液(W/O)､水包油型微乳液(O/W)和油水雙連續型微乳液(B C);而后者是指微乳液與油､水共存于二相或三相平衡中,也有3種結構,即下相微乳液(WinsorⅠ,O/W)､中相微乳液(WinsorⅢ,B C)和上相微乳液(WinsorⅡ,W/O),在這種分類中把單相雙連續微乳液稱WinsorⅣ｡油包水微乳液(W/O)體系逐漸被用作細胞微環境和細胞膜的模擬物,在酶催化和藥物傳遞過程中作為微反應器,為酶催化酯､肽､糖縮醛的合成,酯的醇解和水解反應及對映異構體的拆分開辟了新的途徑｡
    最近發展起來的中相微乳液WinsorⅢ體系中的酶催化反應､含明膠的微乳液凝膠中的固定化酶的酶催化反應在產物分離和酶的重復利用等方面又有重大突破｡另外,有些科技工作者也對表面活性劑其他締合結構體系如囊泡､單層膜､溶致液晶中的酶催化反應進行了研究｡本文將重點討論微乳液反應中應用最廣的脂肪酶的催化反應｡

1微乳液中的酶催化反應

1.1 表面活性劑的選擇對酶催化反應的影響

研究微乳液中酶催化反應所用的表面活性劑一般為陰離子型､陽離子型､兩性型或非離子型表面活性劑｡如:二-(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉(AOT)､十二烷基聚氧乙烯醚(C₁₂E₄)､卵磷脂､十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)等｡其中AOT是一種特性好的､具有雙尾巴的陰離子表面活性劑,不需助表面活性劑,可在很寬的條件下形成反向微乳液,所以AOT是最受歡迎的表面活性劑,AOT微乳液對膠束酶學可作為一種模型體系｡李干佐､Tsai等在研究AOT/異辛烷/磷酸緩沖液中脂肪酶催化油酯的水解反應時發現表面活性劑濃度對Candida Rugosa脂肪酶(CRL)水解活力有影響,且表面活性劑對酶有非競爭性抑制作用｡然后AOT在藥物､化妝品或食品技術區域含酶的微乳液中的應用受到一定限制｡而天然兩性表面活性劑卵磷脂由于其無毒可代替AOT作表面活性劑,由于卵磷脂親油性大,可自發形成微乳液所需的零點曲率磷脂層,適當對該體系加入親水性的助表面活性劑,可使微乳液形成區域大大擴大｡

在非離子表面活性劑溶液中,酯水解的反應速度低､產量低｡這是由于非離子表面活性劑有一個龐大的氧乙烯基鏈的界面層,從而阻止酶和反應底物的接觸和反應｡因此陰離子和非離子表面活性劑微乳液中的這種差別可認為是由于酯與酶的接觸程度不同而引起的｡在AOT體系中脂肪酶可很容易進入到油水界面,而在非離子表面活性劑體系中,聚氧乙烯(PEG)鏈從界面層伸展到膠核內部,從而有效阻止了酶進入到油水界面區,即在蛋白質和PEG層間存在立體排斥作用｡而關于陽離子表面活性劑微乳液中的酶催化反應目前研究較少｡李干佐等曾研究了CTAB/異辛烷/正戊醇/緩沖溶液中糖化酶催化淀粉的水解反應,其反應的最大速度V_n和米氏常數K_n比其在水溶液中分別提高了近6倍和3倍｡

1.2 微乳液中酶的增溶位置

在微乳液中增溶酶后,微乳液的結構會引起改變｡測定酶增溶常用的方法是用熒光能量轉變和光譜技術(如紫外､圓二色性､熒光發射和各向異性､光散射)等｡酶分子在微乳液中的增溶可有兩種位置,即酶分子增溶于微乳液中的水池或吸附于油-水界面層(在表面活性劑極性頭組成的膜附近)｡Ceynowa等認為酶分子通常位于“水池”之中形成一個個微型生物反應器,酶分子周圍被水分子層和一個表面活性劑“殼”包圍著,可以防止油分子進入膠束使酶失活｡底物則大部分溶于有機連續相,少部分分配至“水池”中與酶反應,生成的產物又被萃取到有機相中｡而Avramiotis等用熒光能量轉變研究了在卵磷脂和AOT微乳液中Pseudomonas Cepacia脂肪酶(PCL)的增溶位置,以脂肪酶中色氨酸殘基作供體分子,順式-十八碳四烯酸作為受體分子,測定了微乳液中水含量和順式-十八碳四烯酸與酶的摩爾比對熒光能量轉移效率T的影響,結果表明兩種微乳液體系中酶主要增溶于表面活性劑界面層的附近｡

1.3 溶劑和助表面活性劑的選擇對酶催化反應影響

同一表面活性劑在不同的非極性有機溶劑中形成反相微乳液時,其酶的活力大不相同｡有機溶劑的疏水性是影響酶活力的關鍵因素之一,常以溶劑的1gP值 (P為該溶劑在正辛醇-水兩相中的分配系數)定量地表征溶劑的疏水能力｡溶劑的1gP值越大,則其對反膠束中酶活力的影響越小,這是因為疏水性越強的溶劑分子,滲透到膠核的能力越差,則破壞酶分子構型的能力就小,因此脂肪族烴的碳原子數大于或等于7為好｡但從實驗角度考慮,用低碳原子數的烴為好,因反應后容易將其蒸發除去｡多數微乳液中酶催化反應溶劑選擇一般為庚烷､辛烷(特別是異辛烷)和壬烷｡另外,長鏈的烷烴比短鏈的好,支鏈的或環狀的又比直鏈的好｡這可能是相對分子質量或空間阻礙較大的烷烴對反相微乳液的穩定作用較大,而它們擴散進入“水池”與酶分子發生作用的機會則相對較少｡

Xenakis等研究了在AOT/異辛烷微乳液中脂肪酸和脂肪醇酯化反應的Penicillium Simplicissimum脂肪酶(PSL)的活力,測定了助表面活性劑脂肪醇的鏈長和結構對酶活力的影響｡結果發現PSL催化2-戊醇(仲醇)的反應速度遠高于正戊醇(伯醇)和2-甲基-2-丁醇(叔醇)｡另外,在研究伯醇的碳鏈長度(C₂~C₁₁)對酯化反應中脂肪酶催化活力的影響時發現,隨碳原子數增加PSL催化反應的速度增加,在C=9時達到一平臺最大值｡這可能是由于反相微乳液的結構和大小,底物的性能和反相微乳液中酶的增溶位置決定的｡

1.4 水含量對酶活力的影響

油包水微乳液具有一定大小(納米級)的“水池”,含水量大小常以水與表面活性劑摩爾比Wo表示,即Wo=[H₂O]/[SAA]｡反相微乳液中的水不同于本體水,可劃分為3種:鍵和水､自由水和捕獲水｡在W/O微乳液中進行酶催化反應,含水量是影響酶活性的關鍵因素,文獻表明每種酶都有一個最適Wo值,使酶活力最大｡最佳Wo取決于表面活性劑和酶的性質,酶活力與Wo的關系一般符合鐘形曲線,此時酶表現出的最大活力稱為超活力｡最佳Wo意味著反相微乳液的內核體積與酶分子的體積相適應,當Wo很小時,大部分的酶分子不能增溶于反向微乳液內核,而直接暴露于有機溶劑中而失活;在Wo較低時,酶的活力相對較低,可能是由于不能滿足酶分子周圍需要的一層必須水,而影響了酶活化構象的形成;當Wo較大時,酶活力隨Wo增加而下降,可能是由于微乳液內部水含量的增加,引起酶流動性的增大,導致酶活化構象的破壞,同時Wo太大時,底物濃度下降,也是酶活力降低的因素之一｡

1.5 緩沖液pH對酶活力的影響

酶催化反應的重要特性之一是對微環境的pH非常敏感,緩沖液最佳pH的選擇與酶的種類､反應的類型有關｡在AOT/異辛烷反膠束中,PCL催化三油酸甘油酯的水解時,使用不同的緩沖溶液pH范圍4.0~9.0(乙酸鹽pH=4.0~5.5,磷酸鹽pH=6.0~8.0和Tris-HClpH=8.0~9.0),測得酶的活力與pH值也呈鐘形曲線｡在pH=8.0時,酶的活力最大,此值與PCL在水溶液中的活力基本一致｡研究還發現酶的活力與緩沖液的類型亦有關系,例如在pH=8.0時若用磷酸鹽緩沖液,則酶活力最大,而用Tris-HCl緩沖液時,其最高的酶活力僅是前者的38%｡

而Crooks等在研究AOT的W/O微乳液中Hu-micola Ianuginosa脂肪酶(HIL)和Rhizomucor Miehei脂肪酶(RML)催化對硝基苯基丁酸酯(pNPC₄酯)的水解和酯合成時,發現HIL和RML與緩沖液pH關系不同｡在pNPC₄酯的水解反應中HIL的活力隨緩沖液pH的增大而增大,并呈S形曲線,pH=9.3~10.4時達到最大值｡而MRL的活力與pH值卻呈一典型的鐘形曲線,在pH=7.5時酶活力最大｡但在癸酸辛酯的合成反應中,HIL和RML酯化活力均隨緩沖液pH的增大而逐漸平穩地降低,這種降低不能認為是酶的失活,而是由于癸酸表面活性高,此時癸酸鈉可作為表面活性劑,從而減少了癸酸作為反應底物的濃度,引起酯化反應速度隨pH值增加而降低｡在研究陽離子表面活性劑CTAB的W/O微乳液中Chromobactriumviscosum脂肪酶(CVL)催化癸酸辛酯的合成中,發現酶活力與緩沖液pH的關系,與CVL催化pNPC₄的水解中酶活力與pH值關系呈一倒S形曲線,在低pH值時(pH=4)酶活力最大,隨pH值增大酶活力呈倒S形減小｡而在酯的水解反應中,當Wo=10和Wo=50時,酶活力與pH值關系最小,酶活力在pH=4.0~10.4變化不大,不呈鐘形曲線,亦不呈S曲線｡因為此時反應底物酯為中性的,它的分配性能不受增溶緩沖液pH的影響｡

2中相微乳液WinsorⅢ體系中的酶催化反應

2.1 中相微乳液WinsorⅢ體系中酶､表面活性劑､底物和產物的分配

油包水微乳液中的酶催化反應已有大量報道,但中相微乳液中的酶催化反應目前報道不多｡中相微乳液WinsorⅢ體系中上相為油相､中間相為雙連續微乳液相､下相為水相｡1991年Sonesson等首先報道了肉豆蔻酸甘油三酯在雙尾巴磷酸酯表面活性劑形成的中相微乳液中的脂肪酶催化水解反應｡為確定三相體系中酶的位置,從上相､中相和下相中取樣進行分析酶的活度,發現高于95%的酶存在于中相微乳液｡對上相､中相和下相進行單酸甘油酯､脂肪酸和表面活性劑分析,結果表明上相油相中含有單酸甘油酯和脂肪酸,下相水相含肉豆蔻酸鈉,表面活性劑主要存在于中間相｡當然未反應的肉豆蔻酸甘油三酯,也存在于上相油相中｡與單相微乳液(W/O)反應相比,此法優點在于形成的酯被自動萃取到上相,避免了酯水解反應的發生,可提高酯化反應的產率,此反應在產物的分離上更為有效,有利于酶的重復使用｡而在單相微乳液反應中得到的產物含有大量表面活性劑,產物與表面活性劑的分離需進行多次萃取,操作麻煩｡

2.2 助表面活性劑的選擇對中相微乳液中酶催化反應的影響

Backlund在25℃時用不同的Winsor體系為反應微環境研究了CVL催化己酸和1-戊醇的酯化反應｡助表面活性劑為短鏈醇(2-甲基-1-丙醇､1-丁醇､2-丁醇､2-甲基-1-丁醇､3-甲基-1-丁醇､1-戊醇､2-戊醇､3-戊醇､2-甲基-1-戊醇､3-甲基-1-戊醇､4-甲基-1-戊醇和1 -己醇),其中醇既作為反應底物又作為反應介質的一部分｡研究了不同醇對WinsorⅠ體系到WinsorⅢ體系或具有雙連續結構的WinsorⅣ體系,進一步到WinsorⅡ體系轉變時酯合成的收率｡發現直鏈烷烴的醇或離羥基較遠的碳原子上有分支的醇,都是很有效的助表面活性劑,這兩類醇在低濃度時即可得到WinsorⅢ或WinsorⅣ｡這一現象可通過親水頭基的有效截面積a_h和疏水鏈的有效截面積a_c的比來解釋｡在末端甲基附近有支鏈時使得a_h對a_c的比率減小,助表面活性劑的效率提高,促進體系從WinsorⅠ到Win-sorⅢ轉化;而當甲基與羥基相鄰時,ah對a_c的比率很明顯增加,從而降低助表面活性劑的效率｡在WinsorⅢ體系中,己酸正戊酯的產量是雙連續結構WinsorⅣ體系的2倍,主要是由于在WinsorⅣ體系中,產物酯有水解逆反應發生;而在WinsorⅢ體系中,產物酯可及時被萃取到過剩的油相中,避免了酯的水解｡

3含明膠的微乳液凝膠中固定化酶的酶催化反應

3.1 含酶的微乳液與雙連續微乳液凝膠的結構

80年代末發展起來的含明膠的微乳液凝膠MBGs(Microemulsion-basedgels),開辟了酶固定化的新領域｡含明膠的微乳液凝膠MBGs首先由Haering等于1986年制備｡MBGs的結構測定技術有:擴散､電導､NMR､X射線和小角中子散射等｡MBGs結構模型一般可看作在連續的明膠/水三維網絡中,鑲嵌著許多油包水微乳液液滴(AOT)或雙連續微乳液(卵磷脂)｡Petit等認為MBGs有3種不同結構,其一為在明膠分子的剛性網狀骨架中,纏繞著由表面活性劑膜穩定的油管和水管;其二為在明膠網絡中鑲嵌著穩定的油包水型微乳液滴;其三為在油包水微乳液中含有明膠大分子的一些鏈節,并與明膠的其余部分相連接呈螺旋狀｡含卵磷脂的MBGs結構一般為第一種,而含AOT的MBGs結構一般為第二種或第三種,兩者結構不同｡

3.2 微乳液凝膠中固定化酶的酶催化反應

與油包水微乳液中酶催化相比,MBGs中酶催化反應所得產物的光學純度較高,且易分離,該項技術可連續操作,酶可重復利用和長時間保持其活力和穩定性,這些含有脂肪酶的微乳液凝膠在非極性有機溶劑中運行時可作為一種新的酶固定化方法｡

含有脂肪酶的MBGs以用來合成不同的酯,條件溫和,可進行區域選擇和立體選擇的有機合成反應,也可在-20℃低溫時有效催化酯的合成｡固定在MBGs中的脂肪酶可以接受結構不同分子作底物,如線型､不飽和､支鏈及芳香的環狀酯或醇分子都可進行酯化反應｡含脂肪酶的MBGs與油包水微乳液一樣也可用來催化二醇的酰化反應的區域選擇性,因為1,3-二丁醇和1,5-己二醇實際是水溶性的二醇,這樣在反應開始存在三相(MBGs,油相和底物相),大約30min后變成兩相(MBGs和過量油相),此時的MBGs球狀增溶二醇進行反應｡結果隨著酯化反應的進行溶脹的MBGs小球體積隨后減少到原來的體積｡含脂肪酶的MBGs也可進行立體選擇性合成,如辛醇-3和一些功能性均相化合物的動力學拆分,拆分的程度即對映體過量值(ee)可以合理通過適當降低反應產率以獲得光學純度高的產品｡MBGs中脂肪酶催化動力學拆分的另一特點是能夠在低于零度下反應,如癸酸辛酯的合成溫度范圍30℃~-20℃即使在低于零度時反應速度也很快,說明MBGs固定化酶催化反應的活化能較低(20kJ/mol)｡另外,在MBGs中脂肪酶的催化穩定性也很好,反應30次后其催化初始速度仍達到第一次反應初始速度的75%;并且同一脂肪酶MBGs可以用作催化不同底物的反應,因為對多數反應來說,合成后凝膠中吸附的產物/底物可很容易通過有機溶劑的分配進行分離｡

根據乒乓反應機制CV脂肪酶固定在MBGs中催化癸酸辛酯的合成初始反應速度均與脂肪酶濃度一次方成正比,油包水微乳液和MBGs中表觀速度常數分別為4.4×10^-4和6.1×10^-4mol·g^-1·s^-1｡MBGs在用前需從冷凍室取出并在液氮保護下用研缽研成顆粒,這樣得到的顆粒直徑接近500μm,每10cm³凝膠總面積為10⁶nm²｡在油包水微乳液中由于反應介質是單相可直接用高效液相色譜HPLC分析,而在MBGs中由于MBGs與外部油相接觸,在外部油相中測得的產物濃度僅為表觀濃度｡為了計算在MBGs中總的產物濃度必須考慮到酯在MBGs相和油相中的分配系數(P),P=[酯]_MBG/[酯]油,也必須考慮MBGs相和油相的體積比(VR),VR=V_MBG/V油｡HPLC分析給出外部油相產物濃度隨時間變化的速率d[酯]油/dt｡對由很小凝膠顆粒引起的在相之間的分配,其在MBGs相中的產物形成速度可用下式表示:

d[酯]_MBG/dt=d[酯]油/dt×(1/VR+P)

其中[酯]MBG是凝膠相中純酯的濃度｡酯的分配系數也與MBGs的疏水程度有關,測定的不同組成的分配系數均與油組成的體積分數有關｡例如,在正庚烷的組成為MBGs體積分數的53%時由液相色譜測得癸酸辛酯的分配系數為0.5(±0.03)｡

3.3 雙連續微乳液凝膠中固定化酶的酶催化反應

Backlund等曾研究了CVL和Candidasp脂肪酶固定在明膠包埋的天然兩性表面活性劑大豆卵磷脂/乙醇/水/十六烷雙連續微乳液中,催化外消旋2-辛醇與脂肪酸的酯化反應｡其中短鏈醇既作為底物又作為助表面活性劑,與其他醇會有競爭反應,如:

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