表面活性劑在光合作用研究中應用得較為廣泛 , 光合系統生物膜 ( 即光合膜 ) 中各種色素 - 蛋白復合物的分離､提取和純化以及蛋白的結晶常常要用到表面活性劑 。 可以說 , 正是各種表面活性劑的成功應用才使光合膜的研究深入到現在的分子水平 , 使我們對光合系統中的各種結構和生理功能有了進一步的了解 。 現在 , 用各種表面活性劑來增溶光合膜研究其組分的結構和功能已成為一種常規技術 。 然而 , 在許多研究工作中 , 表面活性劑的應用一般都是經驗性的 。 由于對分離､提純過程中表面活性劑對光合膜中的色素 - 蛋白復合物､復合物中的色素和蛋白質的作用和影響缺乏了解 , 所以不僅分離出的復合物的種類和性質各異 , 而且難以根據分離結果了解活體中的真實情況 , 影響到結果的解釋和所建立的結構模型的準確性 , 因此深入研究表面活性劑的影響是十分必要的 。
此外 , 表面活性劑與光合膜膜脂還具有相似的結構特點 , 即皆為兩性分子 , 因此 , 研究表面活性劑的作用也有助于了解和認識光合膜中膜脂與色素､蛋白之間的相互作用 。
本文以光合膜中的光系統Ⅱ (PS Ⅱ ) 為對象 , 通過紫外熒光光譜和富立葉變換紅外 (FT-IR) 光譜 , 對光系統Ⅱ蛋白質中酪氨酸殘基在陰離子表面活性劑 - 十二烷基硫酸鈉 (sodium dodecyl sulfate, SDS ) 存在下的能量傳遞和結構的變化進行了研究 。
1 實驗
1.1 實驗材料
十二烷基硫酸鈉 ( SDS ) 為美國Sigma公司產品 ( A . R .>99%)。 菠菜 ( S pinacia oleracea L 。) 購自當地市場 。
1.2 方法
1.2.1 PSⅡ顆粒的制備
參照C hapman 等的方法分離､純化 , 稍加改進 : 所得光合膜在緩沖液A (0.4mol/ LS ucrose,5 mmol / LMgCl 2 ,0.2 mol / LNaCl ,50 mmol / LT ricine NaOH , pH 8.0) 中懸浮 , 并省去原方法中第一､二次懸浮步驟 。 最后PSⅡ提取物用緩沖液B (0.4 mol / LS ucrose,15 mmol / LNaCl ,10 mmol / LMes NaOH , pH 6.5) 洗 2 ~ 3 次 , 并以此緩沖液懸浮備用 。 PSⅡ顆粒中的色素濃度按照Arnon的方法測定 。
1.2.2 吸收光譜
采用UVKON -943 型雙波長雙光束分光光度計進行測定 。
1.2.3 熒光光譜
用H itachi MPF -4500 型熒光分光光度計測定室溫和低溫 (77 K ) 的熒光光譜 。
1.2.4 紅外光譜測定
將 1 mg / mL左右的樣品滴加在BaF 2 窗片上 , 通過抽真空使樣品成一層薄膜 , 然后在A vatar 360 紅外光譜儀 ( N icolet I natrument Co , USA ) 上進行紅外光譜的測定 。 將所得圖譜平滑處理后進行二級求導 , 根據二級導數圖譜的負峰以確定子峰的數量及其峰位 。
2 結果
2.1 SDS對PSⅡ蛋白質內部氨基酸之間能量傳遞的影響
在PSⅡ的紫外熒光發射光譜中 ( 圖 1 b ), 只有 304 nm處的熒光發射峰 , 沒有觀察到 325 ~ 350 nm處范圍的熒光峰 ;304 nm處激發的熒光光譜中有 232 nm處和 278 nm處兩個激發峰 ( 圖 1 a ), 其中的 278 nm處激發峰與酪氨酸的吸收峰相對應 。 由此說明 , PSⅡ中 304 nm處的熒光確實是蛋白質的酪氨酸基團發出的 , PSⅡ表現出酪氨酸的熒光特性 。 因此 , PSⅡ膜中的色素 - 蛋白質復合體的載體蛋白 , 按其熒光特性屬于A類蛋白 ( 熒光光譜主要表現酪氨酸的特征 , 最大發射波長約為 304 nm處 )。
此外 , 圖 1 a中 232 nm處激發峰的存在 , 說明在 232 nm處有吸收的蛋白質組分可以將激發能傳遞給酪氨酸基團 , 使它發出熒光 。 該處的吸收可能來自于蛋白質的多肽 , 但也有可能來自于蛋白質的半胱氨酸基團 ( 蛋白質中半胱氨酸殘基在 235 nm處有一吸收峰位 , 且其吸收強度低于酪氨酸和色氨酸 )。 但不管如何 , 有一點可以肯定 , 那就是在PSⅡ載體蛋白的內部存在著位于 232 nm處的組分 , 它吸收光以后 , 可將激發能傳遞給酪氨酸基團 , 使酪氨酸發出 304 nm處的熒光 。
圖 2 示出了不同濃度的SDS對PSⅡ復合物的紫外熒光激發光譜的影響 ｡ 可以看出 , SDS所產生的影響明顯表現在氨基酸熒光強度的改變 ｡ 低濃度的SDS (0｡4 ~ 0｡8 mg / mLSDS ) 就使 232 nm處的組分和酪氨酸殘基的激發熒光下降( 與對照的PSⅡ相比 ), 且產生紅移現象 , 即 232 nm處激發峰移至 235 nm處 , 而278 nm處的激發峰紅移到 281 nm處 ｡ 當SDS濃度增至 1 mg / mL時 , 又使熒光強度有所增加 ｡ 而SDS的濃度繼續增大時 (>2 mg / mLSDS ), 導致兩個激發峰顯著上升 , 且隨SDS濃度的增加而增強 ; 但 235 nm和 281 nm兩處的激發峰位基本保持不變 ｡
2.2 SDS對PSⅡ中氨基酸與色素之間能量傳遞的影響
實驗中我們還發現 , 在PSⅡ中某些氨基酸與色素之間也存在著能量傳遞 。 圖 3 為葉綠素a在 683 nm處發射的紫外熒光激發光譜 。343 nm處是葉綠素a本身的激發峰 , 而 230 nm和 277 nm兩處的激發峰 , 與蛋白質內源熒光 (304 nm ) 激發光譜中的 232 nm和 278 nm相對應 ( 見圖 3), 這反映出在色素 - 蛋白質復合體中蛋白和葉綠素a之間也存在著能量傳遞 , 即載體蛋白中的 232 nm處的組分和酪氨酸殘基 (278 nm ) 都能將激發能傳遞給葉綠素a 。
圖 4 為經不同濃度的SDS處理后葉綠素a的紫外熒光激發光譜 ( 發射波長為 683 nm )。 從圖中可以看出 , SDS對PSⅡ中氨基酸殘基與色素之間的能量傳遞具有很大的影響 , 而且這種影響對載體蛋白中的 232 nm處的組分和酪氨酸殘基具有不同的效應 。 第一 , SDS的存在導致 232 nm處的熒光激發峰消失 。 第二 , 不同濃度的SDS均使 277 nm處的激發熒光增強 , 反映出SDS的存在會阻礙酪氨酸殘基與葉綠素a之間的能量傳遞 。 第三 , 隨SDS濃度的增加 ,277 nm處的激發峰逐漸產生紅移現象 ; 當SDS增加到較高濃度時 (3 ~ 4 mg / mLSDS ), 最終分裂成 254 nm和 282 nm處兩個峰 。
以上結果表明 , 在PSⅡ中存在著載體蛋白與葉綠素a之間的能量傳遞 ｡ SDS的存在會使這種能量的傳遞受到抑制 ｡ 而 232 nm處組分激發峰的消失以及 277 nm處激發峰的最終分裂又表明 ,SDS 的作用有可能引起了 232 nm處組分和酪氨酸殘基本身微環境或結構的改變 ｡
2.3 SDS對PSⅡ中酪氨酸結構的影響
圖 5a和 5b分別是PSⅡ和SDS在 1620 ~ 1500 cm -1 頻率區間的紅外吸收光譜圖 ｡ 在該波段內有酪氨酸殘基的特征吸收 [1620 ~ 1565 cm -1 ( Tyr 8 ),1520 ~ 1500 cm -1 ( T yr 19 )] 和蛋白的酰胺Ⅱ帶 (1565 ~ 1520 cm -1 )｡ 酪氨酸殘基的吸收主要來自于酪氨酸基團苯酚中環的面內骨架伸縮振動 ( Tyr 8 ) 和苯環的伸縮和變形振動 ( Tyr 19 ); 而蛋白的酰胺Ⅱ帶主要是 60% 的N—H面內彎曲振動和 40% 的C—N伸縮振動 ｡ SDS在 1620 ~ 1500 cm -1 波段的吸收較弱 , 所以能較好地反映出由SDS引起的蛋白中酪氨酸殘基的結構變化 ｡
通過對PSⅡ紅外光譜的分析表明 , 在 1620 ~ 1500 cm -1 頻率之間至少存在 7 個吸收譜帶 ｡ 在圖 5c的二級導數譜圖中示出了這 7 個子峰的吸收峰位 ｡1609 cm -1 是屬于芳環的骨架伸縮振動 , 而 1517 cm -1 的吸收峰是來自于芳環的伸縮和變形振動 ｡ COO - 的反對稱伸縮振動在 1570 cm -1 處有一吸收峰 , 而 1554 和 1539 cm -1 兩處的吸收都是來自NH + 3 的對稱彎曲振動 ｡1549 和 1545 cm -1 是蛋白的酰胺Ⅱ帶 ｡
圖6示出了與部分濃度的SDS作用后的PSⅡ紅外吸收光譜圖 ｡ 這些光譜經解析后也有七個子峰 , 沒有產生新的吸收峰 , 也沒有舊峰的消失 , 但有些子峰的吸收峰位發生了改變 ( 見表 1), 主要表現在酪氨酸殘基的特征吸收發生了位移 ｡ 此外 , 從圖 6 的歸一化的圖譜可以看出 , 經與SDS作用后 ,1620 ~ 1565 cm -1 ( Tyr 8),1565 ~ 1520 cm -1 ( 酰胺Ⅱ帶 ) 和 1520 ~ 1500 cm -1 ( Tyr 19 ) 三個特征波段的吸收強度也發生了改變 ｡ 低濃度的SDS導致PSⅡ中酪氨酸殘基的酚環骨架振動和彎曲振動減弱 , 同時使酰胺Ⅱ的吸收增強 ; 而高濃度的SDS卻對PSⅡ產生相反的效應 ｡ 這些紅外結果清楚地反映出在SDS作用下 , PSⅡ中的蛋白骨架以及酪氨酸殘基的結構均受到了影響 ｡
3 討論
我們的結果表明 , PSⅡ表現出酪氨酸熒光的特性 。 在PSⅡ蛋白質內部 , 存在著 232 nm處的組分與酪氨酸之間的能量傳遞以及這兩種氨基酸殘基與葉綠素a之間的能量傳遞 。 SDS的存在會使這些能量傳遞以及PSⅡ中蛋白的骨架結構和酪氨酸殘基的結構受到影響 。
SDS為兩親性有機物 , 即其分子中既含有親水基團也含有疏水基團 。 正是由于這種獨特的分子結構 , 使其在水相中表現出特有的性質 。 低濃度時在表面上進行吸附 , 溶液中的分子以單體形式存在 ; 當表面吸附達飽和時 , 在溶液中分子相互締合形成親水基團向外､疏水基團向內的聚集體 , 即所謂的膠束 , 此時的濃度稱為臨界膠束濃度 ( cmc )。 膠束具有“溶解”其它有機物的性能 ( 表面活性劑的增溶作用 ), 并有可能形成混合膠束 。
就SDS作用于PSⅡ復合物而言 , 首先是降低膜的界面張力 , SDS濃度低時 , SDS分子插入至PSⅡ膜中 。 而SDS濃度增至其臨界膠束濃度時 ( 室溫情況下 , 單純SDS的cmc為 2.30 mg / mL , 在本實驗中Na + 總濃度為 25 mmol / L時按文獻計算cmc為 0.83 mg / mL ), 同膜中的組分形成混合膠束并產生增溶作用 。 當SDS的濃度大于其cmc時 , SDS的增溶作用進一步加強并最終使膜中的蛋白質､色素和脂溶解于其膠束中 。 很顯然 , 不同濃度的SDS都會對膜雙層結構產生擾動進而對影響了膜的生理功能 , PSⅡ中 232 nm處的組分和酪氨酸兩個氨基酸的紫外激發熒光峰位和熒光強度的改變也許就反映了這種影響 。
由圖 2 可知 , 在SDS的存在下 , PSⅡ中 232 nm處的組分和酪氨酸殘基紫外熒光的變化程度明顯受SDS在溶液中聚集狀態的影響 。 低于其cmc時 , SDS使氨基酸的激發峰強度下降 , 使兩個氨基酸之間能量傳遞增強 , 表明SDS的影響使 232 nm處的組分和酪氨酸殘基變為一種激發能態降低､易于傳能的狀態 。 可能是少量SDS分子插入至PSⅡ膜中引起了蛋白質構象適宜的改變 , 使更多 232 nm處的組分接近酪氨酸基團 , 增加了它們之間能量傳遞的機會 。 但SDS的濃度接近或大于其cmc時 , 由于SDS的增溶作用 , 有可能使PSⅡ膜的結構遭到部分或完全的破壞 , 蛋白質的結構受到影響 , 進而影響到 232 nm處的組分和酪氨酸基團 , 導致它們之間的能量傳遞受阻 。
由圖 4 可以看出 , 與產生上述效應不同的是 , 不同濃度的SDS都會阻礙酪氨酸殘基與葉綠素a之間的能量傳遞 , 表明SDS不論是少量插入PSⅡ膜中 , 還是在溶液中形成混合膠束 , 都會使酪氨酸殘基處于一種難以傳能至葉綠素a的狀態 。
紅外結果表明 , 在SDS作用下 , PSⅡ中的蛋白骨架以及酪氨酸殘基的結構均受到了影響 , 主要表現在酪氨酸殘基的特征吸收峰位有所變化 , 以及其吸收強度和蛋白酰胺Ⅱ帶的吸收強度發生了改變 , 而變化方式又明顯受SDS在溶液中聚集狀態的影響 。 即單分子狀態的SDS會使酪氨酸殘基的特征吸收 ( Tyr 8 , Tyr 19 ) 增強和使酰胺Ⅱ帶吸收減弱 , 而以膠束狀態存在的SDS卻產生相反的作用 。
上述紅外振動帶強度的變化表明酪氨酸殘基中酚環的微極性受到了影響 , 這是因為振動帶的強度與振動基團偶極矩變化的平方成正比 , 而偶極矩與介質的介電常數有關 , 吸收帶的強度隨介質極性的增加而增加 , 反之亦然 。 由此說明 , 低濃度 (< cmc ) 的SDS使酪氨酸殘基處于極性更小的環境 , 而高濃度 (> cmc ) 的SDS卻使酪氨酸殘基的微環境發生了較大的改變 , 反而使酪氨酸殘基的微極性增強 。 在本工作中當用非離子表面活性劑TritonX 100 增溶光合膜提取PSⅡ時 , 會不可避免地使部分膜脂從光合膜上脫落 , 因而所得到的PSⅡ與真正活體狀態的PSⅡ所處的膜環境有所不同 。 由于部分膜脂的缺失 , 離體PSⅡ的膜雙層結構因此較為疏松 。 這種疏松的結構增加了膜 / 水的接觸面積 , 因而膜的微環境極性相對較大 。 當少量兩親性SDS分子插入PSⅡ膜時 , 膜的結構排列較為緊密 , 故而膜的微極性相對較小 。 但當SDS濃度較大 (> cmc ) 時 , 由于形成了離子性的SDS膠束而且發生了SDS膠束對PSⅡ的增溶作用 , 因此使PSⅡ處于極性較大的環境 。
總之 , 本工作表明 , PSⅡ表現出酪氨酸熒光的特性 。 在PSⅡ蛋白質內部 , 存在著 232 nm處的組分與酪氨酸之間以及這兩種氨基酸殘基與葉綠素a之間的能量傳遞 。 SDS的存在會使這些能量傳遞以及PSⅡ中蛋白的骨架結構和酪氨酸殘基的結構發生改變 , 而變化方式又明顯受SDS在溶液中聚集狀態的影響 。 低于其cmc時 , SDS會促進蛋白質中 232 nm處的組分與酪氨酸之間的能量傳遞 , 并且使酪氨酸殘基處于極性更小的環境 ; 而大于其cmc時 , SDS卻產生相反的效應 。 但不同濃度的SDS均會抑制酪氨酸殘基至葉綠素a的能量傳遞 。
