當(dāng)今 , 生物技術(shù) ( ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ) 是高技術(shù)的重要支柱 , 已成為研究和發(fā)展的熱點(diǎn)。但是要將一個(gè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化 , 必須解決一系列工程問題。即在首先發(fā)展基因工作、細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工程等“上游” (up-stream process) 過程的基礎(chǔ)上 , 還要發(fā)展“下游” (downstream process) 過程 , 特別是生物產(chǎn)物的分離提取和純化過程 , 因?yàn)樗馁M(fèi)用往往占一種生物產(chǎn)品總成本的 60% ～ 90% 。由于生物產(chǎn)物的特殊性 , 一些通常的化工分離技術(shù)不能直接應(yīng)用 , 必須發(fā)展一些新的生物產(chǎn)物的分離技術(shù)。
　　液 - 液萃取過程 , 尤其是有機(jī)溶劑液 - 液萃取過程 , 由于它具有連續(xù)操作、多級分離、容易放大和便于控制等一系列優(yōu)點(diǎn)而飽受青睞 , 成為化工、石化、冶金等工業(yè)中常用的分離技術(shù)。蛋白質(zhì)類是生物技術(shù)中的重要產(chǎn)物 , 但是大多數(shù)蛋白質(zhì)不溶于有機(jī)溶劑 , 而且與有機(jī)溶劑接觸后會引起蛋白質(zhì)的變性和失活 , 因此不能直接應(yīng)用有機(jī)溶劑液 - 液萃取過程。近年來 , 利用表面活性劑在有機(jī)溶劑中形成一種反向膠團(tuán) ( 簡稱反膠團(tuán) -reversed micelles) 對蛋白質(zhì)進(jìn)行萃取的技術(shù)得到了快速的發(fā)展和應(yīng)用 , 這也是表面活性劑在生物工程中成功應(yīng)用的一個(gè)范例。本文將簡要地介紹該技術(shù)的過程原理和應(yīng)用實(shí)例。
1 反膠團(tuán)的形成
　　正向膠團(tuán) ( ｎｏｒｍａｌｍｉｃｅｌｌｅ ) 是表面活性劑分子在極性溶劑 , 如水中形成的一種親水基團(tuán) ( 頭 ) 朝外 , 而疏水基團(tuán) ( 尾 ) 朝內(nèi)的具有非極性內(nèi)核的多分子聚集體。洗滌劑中的表面活性劑分子在水中形成的就是這種膠團(tuán) , 其非極性內(nèi)核可以溶解各種油污。從而達(dá)到去污的效果。與此相反 , 表面活性劑在非極性溶劑如某些有機(jī)溶劑中就會形成親水頭向內(nèi)和疏水尾向外的具有極性內(nèi)核 ( ｐｏｌａｒｃｏｒｅ ) 的多分子聚集體 ( ａｇ ｇｒｅｇａｔｅｓ ), 由于其表面活性劑的排列方向與一般的正向膠團(tuán)相反 , 因此 , 稱為反膠團(tuán) , 其示意圖如圖 1 。

　　圖 1 　表面活性劑分子在非極性溶劑中形成的反膠團(tuán)
　　反膠團(tuán)的極性內(nèi)核可以溶解某些極性物質(zhì) , 而且在此基礎(chǔ)上還可以溶解一些原來不能溶解的物質(zhì) , 即所謂二次加溶原理。例如 , 反膠團(tuán)的極性內(nèi)核在溶解了水后 , 在內(nèi)核形成了“水池” ( ｗａｔｅｒｐｏｏｌ ), 可以進(jìn)一步溶解蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸等生物活性物質(zhì)。由于膠團(tuán)的屏蔽作用 , 使這些生物物質(zhì)不與有機(jī)溶劑直接接觸 , 而水池的微環(huán)境又保護(hù)了生物物質(zhì)的活性 , 達(dá)到了溶解和分離生物物質(zhì)的目的。圖 2 是解釋此過程的一種常用的模型—“水殼模型”的示意圖。

　　圖 2 　利用反膠團(tuán)將蛋白質(zhì)溶解于有機(jī)溶劑中的水殼模型
　　這種技術(shù)既利用了溶劑萃取的優(yōu)點(diǎn) , 又實(shí)現(xiàn)了生物物質(zhì)的有效分離 , 成為一種新型的生物分離技術(shù)。
2 常用的表面活性劑
　　表面活性劑的種類很多 , 不同的表面活性劑形成的反膠團(tuán)的性質(zhì)也有差異。表 1 為目前研究中常用的表面活性劑及其相應(yīng)的有機(jī)溶劑。其中研究得最多的是ＡＯＴ / 異辛烷體系。ＡＯＴ : 二 -(2- 乙基已基 ) 丁二酸酯磺酸鈉 , 其分子結(jié)構(gòu)示意圖如圖 3 所示。

　　圖 3 ?。粒希苑肿咏Y(jié)構(gòu)示意圖

　　表 1 　常用的表面活性劑及其相應(yīng)的有機(jī)溶劑體系　

　　將表面活性劑溶于溶液中 , 并使其濃度超過臨界膠團(tuán)濃度 ( ｃｍｃ , ｃｒｉｔｉｃａｌｍｉｃｅｌｌｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ) 時(shí) , 表面活性劑就會在溶液中形成聚集體 , 一些表面活性劑的臨界膠團(tuán)濃度如表 2 所示。由表 2 可知 , 表面活性劑的ｃｍｃ值差異很大 , 與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。
　　表 2 　一些表面活性劑的臨界膠團(tuán)濃度 ( ｃｍｃ )

3 反膠團(tuán)體系的分類
3.1 　單一表面活性劑反膠團(tuán)體系
　　研究得最多的是陰離子型ＡＯＴ , 該體系結(jié)構(gòu)簡單和穩(wěn)定 , 反膠團(tuán)體積相對較大 , 適用于等電點(diǎn)較高的較小相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的分離 , 其次有ＤＯＬＰＡ ( 二油基磷酸 ) 。另一類是陽離子表面活性劑 , 如ＣＴＡＢ , ＴＯＭＡＣ , ＤＡＰ ( 十二烷基丙酸銨 ), ＤＤＡＢ ( 二-十二烷基二甲基溴化銨 ) 等。該體系適用于等電點(diǎn)較低的較大相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的分離。而非離子型表面活性劑能構(gòu)成更大的反膠團(tuán) , 但這類體系容易乳化。一般在使用時(shí)無須加入助劑的表面活性劑具有多條中等長度的烷基尾和一個(gè)較小的極性頭 , 如ＡＯＴ , ＤＤＡＢ有二條疏水尾 , 而ＴＯＭＡＣ有三條疏水尾。
3.2 　混合表面活性劑反膠團(tuán)體系
　　這是指兩種或兩種以上表面活性劑構(gòu)成的體系 , 一般來說 , 混合表面活性劑反膠團(tuán)體系對蛋白質(zhì)有更高的分離效率。例如將ＡＯＴ與ＤＥＨＰＡ ( 二 -(2-乙基己基 ) 磷酸 ) 構(gòu)成的混合體系 , 可萃取相對分子質(zhì)量較大的牛血紅蛋白 , 萃取率達(dá) 80% 。其他 , 如ＡＯＴ/ＤＯＬＰＡ , ＡＯＴ/Ｔｗｅｅｎ 85 體系對蛋白質(zhì)的萃取能力都優(yōu)于單一的ＡＯＴ體系。非離子表面活性劑的加入可使反膠團(tuán)變大 , 從而可萃取相對分子質(zhì)量更大的蛋白質(zhì)。
3.3 　親和反膠團(tuán)體系
　　這是指體系中除了有組成膠團(tuán)的表面活性劑外 , 還有具有親和特性的助劑 , 它的親和配基與目標(biāo)蛋白質(zhì)有特異的結(jié)合能力 , 往往極少量親和配基的加入就會使萃取蛋白質(zhì)的選擇性大大提高。例如 , 以一種三嗪藍(lán)染料ＣＢ ( Ｃｉｂａｃｒｏｎ?。拢欤酰?ＧＡ ) 為親和配基 , 極少量的加入ＣＴＡＢ體系后 , 可以萃取原來不被萃取的牛血清白蛋白。
4 影響反膠團(tuán)萃取生物分子的主要因素
4.1 　水相ｐＨ值的影響
　　表面活性劑的極性頭朝向反膠團(tuán)內(nèi)部 , 使反膠團(tuán)的內(nèi)壁帶有一定的電荷。而蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì) , 水相的ｐＨ值決定了蛋白質(zhì)分子表面可電離基團(tuán)的離子化程度 , 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所帶的電荷與反膠團(tuán)內(nèi)所帶的電荷性質(zhì)相反時(shí) , 由于靜電引力 , 可使蛋白質(zhì)于反膠團(tuán)中。例如 : 當(dāng)用陰離子表面活性劑ＡＯＴ構(gòu)成反膠團(tuán)時(shí) , 其內(nèi)壁帶負(fù)電荷 , 若水相的ｐＨ值 < 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)ｐＩ , 則蛋白質(zhì)帶正電荷 , 在靜電引力的作用下 , 使蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠團(tuán)而實(shí)現(xiàn)了萃取。相反 , 當(dāng)ｐＨ > ｐＩ時(shí) , 由于靜電斥力 , 使溶入反膠團(tuán)的蛋白質(zhì)反向萃取出來 , 實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的反萃。若使用的是陽離子表面活性劑 , 則情況與上相反。因此 , 水相的ｐＨ值是影響反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)的最主要因素。
4.2 　水相離子強(qiáng)度的影響
　　水相離子強(qiáng)度的增加產(chǎn)生兩方面的影響:
　　(1) 離子強(qiáng)度影響到反膠團(tuán)內(nèi)壁靜電屏蔽的程度 , 降低了蛋白質(zhì)分子與反膠團(tuán)內(nèi)壁的靜電作用力；
　　(2) 減小了表面活性劑極性頭之間的相互斥力 , 使反膠團(tuán)變小。這兩方面的效應(yīng)都會使蛋白質(zhì)的溶解性下降 , 甚至使已溶解的蛋白質(zhì)從反膠團(tuán)中反萃出來。
4.3 　助表面活性劑的影響
　　蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量往往很大 , 超過幾萬至幾十萬 , 使表面活性劑形成的反膠團(tuán)的大小不足以包容大的蛋白質(zhì) , 而無法實(shí)現(xiàn)萃取。此時(shí) , 加入一些非離子表面活性劑 , 使它們插入反膠團(tuán)的結(jié)構(gòu)中 , 就可以增大反膠團(tuán)的尺寸 , 溶解較大相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)。
4.4 　溶劑體系的影響
　　溶劑的性質(zhì) , 尤其是極性 , 對反膠團(tuán)的形成和大小都有影響 , 常用的溶劑有 : 烷烴類 ( 正己烷、環(huán)己烷、正辛烷、異辛烷、正十二烷等 ) 、四氯化碳、氯仿等等。有時(shí)也用添加助溶劑 , 如醇類 ( 正丁醇等 ) 來調(diào)節(jié)溶劑體系的極性 , 改變反膠團(tuán)的大小 , 增加蛋白質(zhì)的溶解度。
5 應(yīng)用舉例
5.1 　三種蛋白質(zhì)的相互分離
　　利用反膠團(tuán)的方法萃取分離蛋白質(zhì)的研究中 , 應(yīng)當(dāng)提及Ｋ Ｅ Ｇｏｋｌｅｎ及其同事們的工作 , 他們首先采用ＡＯＴ / 異辛烷反膠團(tuán)體系 , 通過調(diào)節(jié)水相的ｐＨ和離子強(qiáng)度 , 分別將α - 核糖核酸酶、細(xì)胞色素Ｃ和溶菌酶從三者的混合液中分離開來。表 3 為這三種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和相對分子質(zhì)量。

　　從表 3 可見 , 它們的相對分子質(zhì)量相近 , 但等電點(diǎn)有一定的差別。圖 4 和圖 5 是ｐＨ值和離子強(qiáng)度對反膠團(tuán)萃取這三種蛋白質(zhì)的影響 , 作者利用這種差別建立了這三種蛋白質(zhì)分離的流程 , 如圖 6 所示。

　　眾所周知 , 當(dāng)ｐＨ>某個(gè)蛋白質(zhì)的ｐＩ時(shí) , 蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷 , 相反時(shí)蛋白質(zhì)帶正電荷。如

圖 4,

　　首先在ｐＨ=9 和較低的離子強(qiáng)度下 , α-核糖核酸酶帶負(fù)電荷不被反膠團(tuán)萃取 , 留在水相中 , 但細(xì)胞色素Ｃ和溶菌酶都帶正電荷 , 可萃入有反膠團(tuán)的有機(jī)相中；第二步 , 見圖 5,

　　利用提高離子強(qiáng)度 , 可將細(xì)胞色素Ｃ從反膠團(tuán)反萃到水相中 ; 最后 , 再提高ｐＨ值和離子強(qiáng)度 , 可將溶菌酶也反萃到水相中。這樣就成功地分離了這三種蛋白質(zhì)。
　　日本學(xué)者利用此體系萃取分離了牛血清蛋白、α - 胰蛋白酶和細(xì)胞色素Ｃ。我們也利用此體系成功地分離了溶菌酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶。
5.2 　從復(fù)雜混合體系中分離蛋白質(zhì)
　　在實(shí)際應(yīng)用中往往遇到的是復(fù)雜的混合體系 , 例如 : 其中既含多種蛋白質(zhì) , 又含有發(fā)酵底物、細(xì)胞碎片、細(xì)胞組織或血液成分 , 從中分離某種蛋白質(zhì)是很困難的。不少研究者對此進(jìn)行了嘗試 , 取得了一定的進(jìn)展。例如 , 用ＡＯＴ / 異辛烷體系 , Ａｒｉｅｓ - Ｂａｒｒｏｓ從細(xì)菌發(fā)酵液中提取了 2 種脂肪酶 ; Ｌｅｓｅｒ從大豆和向日葵中分離了蛋白質(zhì)、油脂和多酚。Ｇｉｏｖｅｎｃｏ利用表面活性劑可以破壞細(xì)胞壁的特點(diǎn) , 用反膠團(tuán)體系直接提取了胞內(nèi)酶。
5.3 　反膠團(tuán)萃取的過程開發(fā)
　?。模澹耄耄澹蚶没旌?- 澄清槽萃取器將反膠團(tuán)萃取和反萃取結(jié)合在一起 , 使反膠團(tuán)溶液在兩個(gè)單元間循環(huán) , 實(shí)現(xiàn)了過程的連續(xù)化操作。如圖 7 所示。

　　其反膠團(tuán)體系為 : ＴＯＭＡＣ / 異辛烷 + 非離子型表面活性劑ＲｅｗｏｐａｌＨＶ 5, 控制值和離子強(qiáng)度 , 萃取和反萃取α-淀粉酶 , 可使酶的濃度提高 17 倍 , 收率達(dá) 85%, 每個(gè)循環(huán)表面活性劑的損失 <2.5% ?！?
5 結(jié)語
　　反膠團(tuán)萃取是利用表面活性劑在有機(jī)溶劑中形成反向膠團(tuán) , 對蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)有效萃取的一種有發(fā)展前途的生物產(chǎn)品的分離技術(shù) , 是表面活性劑在生物工程中應(yīng)用的一個(gè)成功范例。在這種新型的生物分離技術(shù)的發(fā)展中 , 表面活性劑是一個(gè)十分重要的方面。希望本文的簡要介紹能引起人們更大的興趣和參與。
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